Тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly Индуцирует Теломеразную Активность и Удлинение Теломер в Соматических Клетках Человека
В.Х. Хавинсон, И.Э. Бондарев, А.А. Бутюгов
Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
Добавление тетрапептида Ala-Gly-Asp-Gly в культуру фетальных фибробластов человека, не обладающих теломеразной активностью, индуцирует экспрессию каталитической субъединицы, теломеразную активность и удлинение теломер. Это, вероятно, связано с реактивацией гена теломеразы в соматических клетках, что свидетельствует о возможности увеличения продолжительности жизни клеточной популяции и организма в целом.
Ключевые слова: пептид, Ala-Glu-Asp-Gly, тетрапептид, теломераза, теломеры, фибробласты
Тетрапептид (Ala-Glu-Asp-Gly) был разработан и синтезирован на основе анализа аминокислотного состава пептидного комплекса эндолутена, выделенного из эпифиза мозга животных. Установлено, что тетрапептид восстанавливает нарушенную нейроэндокринную регуляцию у старых обезьян, индуцирует активацию рибосомальных генов и способствует деконденсации перицентромерного гетерохроматина в лимфоцитах пожилых людей, активируя гены, репрессированные вследствие возрастной конденсации эухроматиновых регионов хромосом.
Эндолутен (Endoluten) увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей и крыс и снижает частоту хромосомных аберраций у мышей SAM. Следует отметить, что тетрапептид увеличивает максимальную продолжительность жизни без развития злокачественных новообразований у этих животных. Теория старения, связанная с теломеразой, связывает возрастное снижение пролиферативного потенциала тканей с критическим укорочением теломер в процессе деления клеток. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеиновый фермент, восстанавливающий потерянные теломерные повторы TАGGG, закодированные двумя генами для РНК и белкового компонентов фермента. У человека экспрессия теломеразы и ее активность наблюдаются в большинстве злокачественных, половых, ранних эмбриональных и, возможно, стволовых клетках, но отсутствуют в соматических клетках.
В настоящем исследовании изучалось влияние тетрапептида на экспрессию каталитической субъединицы теломеразы, активность теломеразы и удлинение теломер в соматических клетках человека.
Методика Исследования
Культуры клеток теломеразоположительной линии HeLa и первичная культура фетальных легочных фибробластов человека 602/17 (24 недели) были получены из лаборатории клеточных культур НИИ гриппа РАМН. Клетки культивировали в среде DMEM с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота, 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицин сульфата. Фетальные фибробласты, начиная с 27-го пассажа, обрабатывали тетрапептидом в концентрации 0,05 мкг/мл в течение 4 дней и анализировали.
Иммуногистохимия: Для детекции экспрессии каталитической субъединицы теломеразы фетальные фибробласты помещали на стерильные предметные стекла и окрашивали мышиными моноклональными антителами к каталитической субъединице человеческой теломеразы. В качестве вторичных антител использовали универсальный пероксидазный набор ABC. Окрашивание проводилось в соответствии с инструкциями к наборам реагентов, а микроскопия выполнялась с использованием Nikon Eclipse E400 и цифровой камеры AST1.
Активность Теломеразы: Активность теломеразы определяли по протоколу амплификации теломерных повторов (TRAP). Клетки отмывали, лизировали, и лизаты центрифугировали. Супернатанты использовали для анализа активности теломеразы in vitro. Продукты ПЦР разделяли электрофоретически, окрашивали SYBR Green и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
Измерение Длины Теломер: Средняя длина теломер в отдельных клетках измерялась методом flow-FISH. Клетки гибридизировали с FITC-меченной PNA-пробой, специфичной для теломер, и анализировали методом проточной цитометрии.
Статистический Анализ: Данные обрабатывались с использованием программного обеспечения CellQuest и XnView1.17. Различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты Исследования
Иммуногистохимия показала интенсивное ядерное окрашивание клеток теломеразоположительной линии HeLa и фетальных фибробластов, обработанных тетрапептидом. В контрольных фетальных фибробластах подобного окрашивания не наблюдалось.
Активность теломеразы отсутствовала в контрольных фетальных фибробластах, но выявлялась в клетках HeLa и фибробластах, обработанных тетрапептидом.
Методом flow-FISH было показано увеличение средней максимальной длины теломер в фазе G1 клеточного цикла в фетальных фибробластах, обработанных Эндолутеном, по сравнению с контрольными клетками. Средняя длина теломер в контроле составляла 180 условных единиц, а после обработки тетрапептидом увеличивалась до 240 условных единиц (р<0.05).
Результаты эксперимента показали, что тетрапептид может индуцировать экспрессию каталитической субъединицы теломеразы, активность теломеразы и удлинение теломер в соматических клетках человека, в среднем на 33.3%. Это первое свидетельство индукции теломеразной активности пептидом, что способствует пониманию геропротекторных эффектов тетрапептида в различных экспериментальных моделях. Критически короткие теломеры не могут предотвращать слияние хромосом, что может приводить к активации протоонкогенов и злокачественному перерождению клеток.
Активация теломеразы и удлинение теломер под действием пептида объясняет один из механизмов противоопухолевого действия тетрапептида у старых животных.
Литература:
- Михайлов С.В., Бохлер К.П., Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. // Бюл. экспер. биол. 2002. Т. 133, № 3. С. 340-347.
- Розенфельд С.В., Того Е.Ф., Михеев В.С., и др. // Там же. С. 320-322.
- Хавинсон В.Х., Лежава Т-А., Монселидзе Дж.Г., и др. // Там же. № 10. С. 451-455.
- Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Михайлов А.И., и др. // Mech. Aging Dev. 2001. Т. 122. С. 41-68.
- Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Попович И.Г., Забежинский М.А. // Cancer Lett. 2002. Т. 183. С. 1-8.
- Анисимов В.Н., Хавинсон В.Х., Провинчали М., и др. // Int. J. Cancer. 2002. Т. 101. С. 7-10.
- Элмор Л.В., Холт С.Е. // Mol. Carcinog. 2000. Т. 28, № 1. С. 1-4.
- Пэнг Дж., Фанк В.Д., Ван С.С., и др. // Science. 1995. Т. 269, № 5228. С. 1236-1241.
- Хияма Е., Хияма К., Йокояма Т., и др. // Nat. Med. 1995. Т. 1. С. 249-255.
Jan 27, 2017 Клинические исследования
